Improving CRISPR-Cas9 directed faithful transgene integration outcomes by reducing unwanted random DNA integration.

BACKGROUND: The field of genome editing has been revolutionized by the development of an easily programmable editing tool, the CRISPR-Cas9. Despite its promise, off-target activity of Cas9 posed a great disadvantage for genome editing purposes by causing DNA double strand breaks at off-target locations and causing unwanted editing outcomes. Furthermore, for gene integration applications, which introduce transgene sequences, integration of transgenes to off-target sites could be harmful, hard to detect, and reduce faithful genome editing efficiency. METHOD: Here we report the development of a multicolour fluorescence assay for studying CRISPR-Cas9-directed gene integration at an endogenous locus in human cell lines. We examine genetic integration of reporter genes in transiently transfected cells as well as puromycin-selected stable cell lines to determine the fidelity of multiple CRISPR-Cas9 strategies. RESULT: We found that there is a high occurrence of unwanted DNA integration which tarnished faithful knock-in efficiency. Integration outcomes are influenced by the type of DNA DSBs, donor design, the use of enhanced specificity Cas9 variants, with S-phase regulated Cas9 activity. Moreover, restricting Cas9 expression with a self-cleaving system greatly improves knock-in outcomes by substantially reducing the percentage of cells with unwanted DNA integration. CONCLUSION: Our results highlight the need for a more stringent assessment of CRISPR-Cas9-mediated knock-in outcomes, and the importance of careful strategy design to maximise efficient and faithful transgene integration.

Molecular and functional correction of a deep intronic splicing mutation in CFTR by CRISPR-Cas9 gene editing.

Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the CFTR gene. The 10th most common mutation, c.3178-2477C>T (3849+10kb C>T), involves a cryptic, intronic splice site. This mutation was corrected in CF primary cells homozygous for this mutation by delivering pairs of guide RNAs (gRNAs) with Cas9 protein in ribonucleoprotein (RNP) complexes that introduce double-strand breaks to flanking sites to excise the 3849+10kb C>T mutation, followed by DNA repair by the non-homologous end-joining pathway, which functions in all cells of the airway epithelium. RNP complexes were delivered to CF basal epithelial cell by a non-viral, receptor-targeted nanocomplex comprising a formulation of targeting peptides and lipids. Canonical CFTR mRNA splicing was, thus, restored leading to the restoration of CFTR protein expression with concomitant restoration of electrophysiological function in airway epithelial air-liquid interface cultures. Off-target editing was not detected by Sanger sequencing of in silico-selected genomic sites with the highest sequence similarities to the gRNAs, although more sensitive unbiased whole genome sequencing methods would be required for possible translational developments. This approach could potentially be used to correct aberrant splicing signals in several other CF mutations and other genetic disorders where deep-intronic mutations are pathogenic.

Estudio descriptivo: nivel de comprensión lectora, frecuencia de lectura, alumnos de escuela secundaria ManuelBelgrano N§ 236 María Susana (Provincia Santa Fe) en el año 1999 / Description study: level of read comprehension, frecuency of read, student of secondary school Manuel Belgrano N§ 236 María Susana (Santa Fe) en el año 1999

El presente trabajo consistió en un estudio de tipo descriptivo transversal y exploratorio en el que se intentó conocer en que situación se encontraban las variables: nivel de comprensión lectora, sus dificultades y frecuencia de lectura; las relaciones de las mismas y también la relación del nivel de comprensión lectora con la edad y con el nivel instruccional de los padres. La población investigada estuvo integrada por una muestra de adolescentes que cursaban en la Escuela de Enseñanza Media N§ 236 de la localidad de María Susana durante el mes de octubre de 1999 y cuyas edades oscilaban entre los trece y los dieciocho años inclusive. Para recabar los datos pertinentes a la variable "nivel de comprensión lectora" se utilizó un texto para ser leído y un cuestionario guía con once consignas. La variable "frecuencia de la lectura" y las variables secundarias se midieron a través de una encuesta. Los resultados arrojados fueron: "el nivel de comprensión lectora" entre bueno (45,8 por ciento) y regular (37,5 por ciento). Las mayores dificultades encontradas consistieron en: dificultad para reconocer los contenidos textuales, para identificar ideas principales, deficiencias léxicos semánticas y desconocimiento de una estructura sintáctica compleja. La edad influyó en el nivel comprensivo; en cambio, el nivel instruccional de los padres no modificó directamente el nivel comprensivo de esta población. El dato más relevante fue que la frecuencia de lectura investigada aumenta en relación con el aumento del nivel comprensivo

Estudio descriptivo: nivel de comprensión lectora, frecuencia de lectura, alumnos de escuela secundaria ManuelBelgrano Nº 236 María Susana (Provincia Santa Fe) en el año 1999 / Description study: level of read comprehension, frecuency of read, student of secondary school Manuel Belgrano Nº 236 María Susana (Santa Fe) en el año 1999

El presente trabajo consistió en un estudio de tipo descriptivo transversal y exploratorio en el que se intentó conocer en que situación se encontraban las variables: nivel de comprensión lectora, sus dificultades y frecuencia de lectura; las relaciones de las mismas y también la relación del nivel de comprensión lectora con la edad y con el nivel instruccional de los padres. La población investigada estuvo integrada por una muestra de adolescentes que cursaban en la Escuela de Enseñanza Media Nº 236 de la localidad de María Susana durante el mes de octubre de 1999 y cuyas edades oscilaban entre los trece y los dieciocho años inclusive. Para recabar los datos pertinentes a la variable "nivel de comprensión lectora" se utilizó un texto para ser le